密码子的探索发现过程
Image 今天来学习一篇经典论文，它来自1961年的《Nature》杂志，作者是著名的Francis Crick及其同事们。文献DOI是 10.1038/1921227a0 ，点击文末的“阅读原文”可跳转至该论文全文。
这项研究工作是关于密码子（genetic codon）的。密码子在生物学中意义非凡，是生物化学与分子生物学专业课上必定会涵盖的重要内容，但我们一般只通过教材学习其最终结论。事实上，针对这类知识，追溯到其产生的经典论文中进行深入学习，对于理解生命科学是如何一步步演进，掌握我们该如何继续探索未知，都是极具价值的。
这篇文章一共解决了四个重要问题：
密码子由三个碱基组成。
密码子不重叠。
序列起始于特定密码子。
密码子表是简并的。 具体来说下这篇论文的一些关键内容：
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首先，关于密码子之间不重叠，其证据来自Wittmann等人在烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，简称TMV）中的工作。TMV是一种RNA病毒，其遗传物质是单链RNA（ssRNA），这使它很容易在体外操作，用于研究以RNA为模板进行蛋白质合成的过程。下图来自文章Fig.1：
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它展示了“重叠密码子”和“非重叠密码子”两种理论策略的差异。如果重叠，则一个碱基变化，应该会引起连续三个氨基酸的变化。于是，是否重叠的问题，就转换成为测定蛋白质序列、并统计其差异氨基酸组成及位置的问题。由于观测到的连续氨基酸变化的情况非常罕见，从而排除了“重叠密码子”这种策略，而得到了“密码子不重叠”的结论。
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生物学研究中，实验体系至关重要。一个合适的实验体系，能够为问题的研究，发挥事半功倍的效果。在密码子的研究中，他们使用了T4噬菌体，一种会攻击大肠杆菌的病毒。该噬菌体会把自己的核酸片段，以插入的方式，整合到大肠杆菌的基因组中，并随着细菌的繁殖而得到复制，并在合适的时机杀死大肠杆菌，释放大量病毒个体。与TMV一样，T4噬菌体也是重要的模式生物，它们帮助我们做出了很多生物学上的重要发现。
在密码子的研究中，被重点关注的，是T4核酸上排布的两个相邻基因（在这篇文章中提到的这个“基因”概念，与我们今天通常说的基因是不太一样的；这篇文章里应该是指同一个蛋白编码序列的上下游发生突变的两个位点），被称作“顺反子”（cistron）。它们收集了大量的噬菌体株，确定其对大肠杆菌的杀伤能力（表型），同时测定其发生突变的位置（虽然那时候的技术还没法准确测定到每个单碱基的精度，但定位大致区域及相对位置还是可以的），根据表型确定这些突变是否产生了“抑制”（suppress）作用，或是对“抑制”产生了“抑制”（as suppressors of suppressors）。
于是，利用这套体系，他们通过对双突变的解释，来确认了密码子的相关过程及属性。文章的Fig.3中展示了“插入”（addition）和“缺失”（deletion）两种突变的互补修复关系：
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密码子由三个碱基组成，其实首先来自理论推导。
当时发现的核酸酸共有四种，而氨基酸共有20种。要用四种核苷酸的组合来表示20种氨基酸：若只用两个核苷酸表示，则一共可以代表4x4=16种组合；若用三个核苷酸，则可以表示4x4x4=64种组合；因此，表示20种氨基酸，最少所需的核苷酸数便是3。
在这篇论文中，他们对噬菌体株及其携带突变进行了筛选，只选择那些发生了插入或缺失的位点，分别用 + 和 - 表示：
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这里用了数学上的一个取模（modulo）运算，上图中的 m 表示插入或缺失的碱基数，而 n 表示理论上估算的密码子的大小（即密码子由几个碱基组成）。并用之前提到的“插入”与“缺失“互补修复的原理，根据观察到的大量噬菌体株的数据，最终成功推算出 n 是 3（或3的倍数）。
对于到底是 3 还是 3 的某个倍数，仍然是采用了理论计算和观察结果的概率比较的方法。通过精心选取的两对噬菌体株（+ / + 和 - / -，且它们有一个突变处在非常接近的位置，因而在杂交过程中容易被互相覆盖）进行杂交，并观测其杂交结果，从而排除了后者。
同时，除了双突变的情况，他们还考察了三突变（包括 + / + / + 和 - / - / -）即三个突变都同为“插入”或同为“缺失”的情况，这种三个突变叠加使表型得到恢复的结果，也进一步印证了密码子大小为 3 的结论。
这篇经典论文，是我个人特别喜欢的一项研究工作。在那个人们对遗传信息究竟如何存储都还知之甚少的年代，PCR实验和自动测序仪都尚未诞生，更别提如今各种纷繁复杂、强大无比的生物分子精确操作技术，就在这样的“原始”条件下，他们延续了1953年DNA双螺旋结构发现所带来的激动人心，通过整合当时不同实验室的探索成果，结合理论推导，并设计巧妙的实验加以验证，最终提出了至今仍然成立的密码子学说。
本文是我个人学习文献的笔记，其中难免存在理解偏差或描述不当之处。欢迎指正和交流，也强烈推荐阅读论文原文一起学习。
注：本文首发表于“不靠谱颜论”公众号，并同步至本站。